Goran Neshich
Esta proposta reflete o interesse especifico de atividades na area da Biofisica Estrutural em estabelecimento do Laboratorio da Bioquimica das MacroMoleculas. No mesmo tempo foi tambem considerado o conceito do novo Laboratorio em termos das necesidades dos projetos da BioTecnologia do CENARGEN/EMBRAPA.
O documento esta sendo presentado em forma de 10 perguntas criticas e respostas creativas, identificando a demanda, a equipe, o equipamento, o espaço necessario, gerenciamento e a liderança do futuro Laboratorio.
P1. O que é a Biofisica Estrutural (BE) e a Bioquimica de macromoleculas (BQM)?
R1: O conceito geral da organização da atividade de BioFisica Estrutural da Macromoleculas foi formulado em 1989 da seguinte maneira:
Precisamos formar o ambiente com equipamento, logistica e equipe na area de:
i) analise dos parametros vectoriais e tensoriais das sequencias das macromoleculas; Esta atividade é definida como a BioInformatica e ate agora resultou em formação e a definição das algumas atividades de o que hoje chamamos no CENARGEN o Laboratorio da BioInformatica.
ii) Modelagem grafica e calculos de dinamica, mecanica e eletrostatica dos moleculas; Esta atividade esta definida como Modelagem das proteinas, mas na verdade teria que ser renomiada para Modelagem MacroMolecular,
iii) Bioquimica preparativa das macromoleculas (purificação, sequenciamento, sintese e caracterização das proteinas e DNA); e finalmente
iv) Bioquimica das interaçoes macromoleculares (cinetica e termodinamica dos complexos macromoleculares)
Os itens iii) e iv) determinam as atividades do Laboratorio de BQM.
P2: Quais são as perguntas cientificas que BE e BQM devem responder dentro das atividades da pesquisa no CENARGEN?
R2: O intendimento dos processos biologicos no nivel molecular só poderia ser desenvolvido dentro do um conceito de combinaçao das duas esencialmente separadas areas: descrição funcional e detalhada investigação de estrutura dos sistemas biologicos.
A Biofisica Estrutural teria que responder uma unica pergunta aplicada em variedade de casos bilogicos: Qual é a relação entre estrutura das macromoleculas e a função que elas tem no ambito de processos biologicos. A Bioquimica Macromolecular do outro lado deveria ser considerada como uma ferramenta (purificação, sequenciamento etc) e não a finalidade no complexo das atividades da BE. Entretanto, BQM teria que assumir a liderança nas atividades que tocam o assunto de cinetica e a termodinamica das interações das macromoleculas. A pergunta cientifica adequada para a BQM (na verdade a BioQuimica das Interações MacroMoleculares -BIM)seria: Quais são os parametros termodinamicos que acompanham interação entre duas moleculas.
É oportuno aqui mencionar que a BE é uma mistura fascinante de Biologia Molecular + Estudos de estrutura das macromoleculas + computação e + a Bioquimica, todos em dosagens adequadas com a coordenação bem planejada.
Gostaria de salientar aqui que por custo extremamente elevado de implementação das tecnicas “diretas” de decifrar a estrutura das macromoleculas (X-ray crystallography e mais caro ainda o NMR), fica inviavel partir para formação do um laboratorio deste tipo, ainda mais por falta absoluta da equipe treinada para estas atividades. A BE foi concetualizada no princiopios de empregar as tecnicas da biofisica e a bioquimica que podem providenciar o espectro das informações sobre a estrutura das macromoleculas com o custo mais rasuavel e a equipe que poderia ser formada com menos tempo de treinamento.
P3: Qual é a diferença entre Bioquimica preparativa (BP) e a Bioquimica das interações MacroMoleculares (BIM)?
R3:A BP, como o proprio nome indica, teria que preparar as amostras das macromoleculas para outros estudos. As atividades poderiam ser adequadamente grupadas na seguinte maneira:
i)purificação das macromoleculas
ii) sequenciamento
iii) amino acid analisys
iv) Iso-Electric Focusing
v) determinaçã das pontes de disulfeto
vi) expressão das proteinas mutagenizadas em outros hospedeiros
etc...
Já a Bioquimica das interações MacroMoleculares (BIM) teria que se preocupar com as perguntas do tipo:
a) quais sao os componentes das macromoleculas que interagem?
b) interação ocorre sob quais condiçoes?
c) qual é a velocidade de ligação e da disociação das macromoleculas?
d) Quanto é forte a ligação entre macromoleculas (em termos energeticos)?
e) Quanto dos macromoleculas interagindo é em estado ativo?
f) Como é que os efetores, cofatores, e as modificações moleculares influenciam a interação entre macromoleculas?
P4: Quais são as atividades da area de Biologia Molecular necessarias para acompanhar o desenvolvimento da BE e BM?
R4:Adequado acompanhamento da area de Biologia Molecular envolveria as atividades como:
a) mutagenese sitio-dirigida das proteinas e os genes
b) expressao das proteinas mutadas em outros hospedeiros
c) produção dos anticorpos
etc.
P5: Qual equipamento seria necessario para adquirir para as atividades da BP e BIM?
R5:Para BP precisariamos todos os equipamentos do tipo:
*HPLC,
*FPLC,
*gel running equipment,
*colunas de varias caracteristicas,
*coletores das frações,
*espectrofotometros etc.
Seria muito bom se o novo laboratorio poderia adquirir o
*sequenciador automatico das proteinas e
*sequenciador automatico da DNA, como tambem o
*sintetisador dos nucleotideos.
Considero tambem que para as atividades da BE (e as outras de carater generico para os projetos do CENARGEN/EMBRAPA), seria de absoluta prioridade adquirir os equipamentos caracterisados por alto grau de automatização dos processos como é a purificação:
** Um exmplo é BioCAD Workstation que emprega a “Perfusion Chromatography” para obter em pouco tempo as condições otimas para purificar as amostras proteicas em grandes quantidades.
**Outro examplo seria na parte dos kites modernos para purificação “dirigida” como é o caso da QUIexpress - a purificação das proteinas recombinantes usando metal-chelate chromatography.
**Seria tambem necessario adquirir o sistema automatico de quantificação computadorizada das bandas proteicas e/ou da DNA nos “gels”, para rapida analise dos resultados.
Na parte de Bioquimica da Interações Macromoleculares seria impresendivel (alem de contar com uma infra estrutura descrita para a parte de BP) adquirir os seguintes equipamentos:
a) Isothermal Titration Calorimeter (ITC)
b) Differential Scanning Calorimeter (DSC)
c) Biomolecular Interaction Analysis (BIA) BIAcore System
d) fluorescence quenching spectrophotometer
As perguntas cientificas que estes equipamentos podem responder são seguintes:
a)
i)determinação da “binding constant”
ii) determinação da stoichiometry
iii) determinação da “heat and entropy of binding”
b)
mesmos parametros termodinamicos como no caso a) mas com maior precissão.
c)
O BIAcore é um equipamento que emprega o principio de “surface plasmon resonance” que detecta as mudanças de “refractive index”de solução perto de superficie do chip sensor. Usando este equipamento podemos responder:
i) quais sao os componentes das macromoleculas que interagem?
ii) interação ocorre sob quais condiçoes?
iii) qual é a velocidade de ligação e da disociação das macromoleculas?
iv) Quanto é forte a ligação entre macromoleculas (em termos energeticos)?
v) Quanto do macromoleculas interagindo é em estado ativo?
vi) Como é que os efetores, cofatores, e as modificações moleculares influenciam a interação entre macromoleculas?
Tudo isto com o minimo de gasto da amostra proteica/DNA, sem necessidade de ter a proteina purificada e nem solubilizados.
d) Fluorescent quenching espectrometro principalmente serviria para responder as perguntas como:
i)quais são os amino-acidos aromaticos expostos ao solvente (portanto incontram se na superficie da proteina) e quais são localizados no interior da globula proteica?
Esta questao é um teste muito importante para verificar a hipotese feita sobre o “protein folding” e a estrutura dos complexos macromolecularis.
P6: Qual é a equipe necessaria para ser formada para a BP e a BIM?
R6: A equipe que poderia exercer suas atividades dentro do conceito do Laboratorio da BQM em geral no momento esta sendo trinada e é incompleta.
O Sr. Thales Lima Rocha e a Sr-a Luciane Mello estão na post- graduação em Edinborough e Leeds, respetivamente, e vão receber o trainamento desejado para a area de BE em geral (mistura de Biologia Molecular, Bioquimica preparativa, BIM e tambem Modelagem Macromolecular). A Sr-a Maria Cristina Mattar esta em fase final de decidir para qual laboratorio vai para conduzir parte pratica do seu PhD.
Necessitamos contratar pessoas com experiencia na area , trazer consultores no curto e medio praso e atrair os estudantes da UnB e usar a collaboração internacional - estudantes da China por examplo.
P7: Qual é o espaço necessario para as atividades de BP e a BIM?
R7:O espaço fisico depende muito da extenção da equipe e do equipamento adquirido. Uma preliminar estimativa seria que o predio novo da Biotecnologia teria que reservar uma camara fria e mais 5 (cinco) laboratorios para abrigar a maioria dos equipamentos mencionados nesta proposta. Seria tambem necessario prever o espaço dos escritorios para os membros da equipe: dois lideris (BP e BIM), 3 integrantes da equipe e mais 5 estudantes.
P8: Que tipo de gerenciamento seria adequado para o Laboratoria de BM?
R8: O gerenciamento seria a consequencia da funcionalidade e dentro da organização geral da Biotecnologia. Sugestão aqui seria que existem dois lideres: parte da BP e BIM, uma secretaria responsavel para parte administrativa. Seria implementada a delegação das tarefas gerais para os integrantes da equipe. Delegar as tarefas seria primariamente com a fianlidade de preservar o tempo dos lideres para as atividades de pesquisa.
P9: Que tipo de liderança seria adequado para o Laboratorio da BQM?
R9:A liderança hierarcica seria de parte tecnica da chefia adjunta da Biotecnologia dividindo as tarefas de projeção das necessidades e visão da desenvolvimento da BQM com os lideres dos grupos da BP e da BIM.
P10: Como financiar as atividades do Laboratorio da BM?
R10:Existem duas etapas e esferas de investimento:
1. decisão institucional (caso EMBRAPA/CENARGEN) de investir na area/laboratorio para consiguir efetivamente concluir e cumprir as tarefas e a proposta do trabalho no plano diretor da unidade. O PDU obviamente teria que refletir o interesse da comunidade em assuntos estrategicos. A Bioquimica MacroMolecular sem duvida nenhuma é a parte de requisitos absolutamente necessarios para o CENARGEN poder cumprir sua missão.
2. Uma vez estabelecida infraestrutura basica, a equipe teria obrigação de entrar no mercado competitivo de agencias financiadoras para pedir os recursos para sustenção das suas atividades.
Este tipo de classificação das responsabilidades em financiamento do laboratorio novo é extremamente eficaz, quebrando efetivamente o circulo vicioso de:
**dever representar os resultados para
**poder requerer os fundos na frente das agencias financiadoras. Claro que parte deste circulo é o
**fato de nao poder apresentar os resultados por
**falta de equipamente, equipe, espaço fisico etc.
Sugerimos portanto que a EMBRAPA financiace a compra inicial do equipamento descrito aqui, ajudace com a contratação da equipe, financiando tambem as consutlorias nacionais e internacionais (aproveitando, claro, o investimento já feito para novo predio da Biotecnologia).
Custeio total necessario para compra do equipamento seria:
A) para parte de BIM............................US$450,000.00
b) para parte de BP..............................US$550,000.00
Os numeros presentados foram levantados consultando os catalogos e sem uma proposta oficial dos produtores de equipamento. No caso A) de BIM, todos os quatro equipamentos foram incluidos no preço total, já no caso B) da BP, não foram incluidos sequenciadores automaticos das proteinas e da DNA!
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Goran Neshich
Brasilia, 7 de Fevereiro de 1996